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　　組織培養(yǎng)的步驟

　　培養(yǎng)基配制

　　配制培養(yǎng)基有兩種方法可以選擇，一是購(gòu)買培養(yǎng)基中所有化學(xué)藥品，按照需要自己配制；二是購(gòu)買商品的混合好的培養(yǎng)基基本成分粉劑，如MS、B5等。自己配制可以節(jié)約費(fèi)用，但浪費(fèi)時(shí)間、人力、且有時(shí)由于藥品的質(zhì)量問題，給實(shí)驗(yàn)帶來麻煩。目前國(guó)內(nèi)的情況看，多數(shù)還是自己配制。

　　1、配制幾種母液

　　一般配制成100倍MS有機(jī)母液。配成1L母液，倒入1L試劑瓶中，存放于冰箱中。

　　1.1配制MS大量元素母液

　　1.2配制MS微量元素母液

　　1.3配制MS有機(jī)母液

　　1.4配制MS鐵鹽母液

　　MS母液有5種大量元素母液，加上MS微量元素母液、MS有機(jī)母液和MS鐵鹽母液，共8種母液。

　　2、激素母液的配制

　　各種生長(zhǎng)素和細(xì)胞分裂素要單獨(dú)配制，不能混合在一起，生長(zhǎng)素類一般要先用少量95%的酒精或1當(dāng)量的NaOH溶解，細(xì)胞分裂素一般要先用1當(dāng)量的鹽酸溶解，然后再加蒸餾水定容。一般取100mg配成100ml母液。

　　3、配制培養(yǎng)基

　　以配置1L MS培養(yǎng)基為例，按順序進(jìn)行如下操作：

　　3.1先在燒杯中放入一些蒸餾水。

　　3.2分別取上面八種母液10ml倒入。

　　3.3一般稱取30g蔗糖倒入，攪拌溶解。

　　3.4加蒸餾水用量筒定溶至1L。

　　3.5按設(shè)計(jì)好的方案添加各種激素，由于激素的用量很小，而且激素對(duì)組培植物的生長(zhǎng)至關(guān)重要。所以有條件的話好用微量可調(diào)移液器吸取，減少誤差。

　　3.6用精密試紙或酸度計(jì)調(diào)整PH至5.7～5.8。（有條件的話使用酸度計(jì)，比較精確） 可配1當(dāng)量的HCL和1當(dāng)量的NaOH用來調(diào)溶液PH值。

　　1當(dāng)量HCL配制：用量筒量取8.3ml配成100ml溶液。

　　1當(dāng)量NaOH配制：稱取NaOH 4g 配成100ml溶液。

　　3.7稱取5g左右瓊脂粉（質(zhì)量好的瓊脂粉),倒入上面配好的溶液中，放在電爐上加熱至沸騰，直到瓊脂粉熔化。

　　3.8稍微冷卻后，分裝入培養(yǎng)容器中。無蓋的培養(yǎng)容器要用封口膜或牛皮紙封口，用橡皮筋或繩子扎緊。

　　3.9放入消毒滅菌鍋滅菌，滅菌20分鐘左右。

　　3.10滅菌后從滅菌鍋中取出培養(yǎng)基，平放在實(shí)驗(yàn)臺(tái)上令其冷卻凝固。

　　滅菌

　　滅菌是組織培養(yǎng)重要的工作之一。初學(xué)者要清楚有菌和無菌的范疇。有菌的范疇是：凡是暴露在空氣中的物體，接觸自然水源的物體，至少它的表面都是有菌的。依此觀點(diǎn)，無菌室等未處理的地方、超凈臺(tái)的表面、簡(jiǎn)單煮沸的培養(yǎng)基、我們使用的刀、剪在未處理之前、我們身體的整個(gè)外表及與外界相連的內(nèi)表，如整個(gè)消化道、呼吸道，即我們呼出的氣體、培養(yǎng)容器無論洗得多干凈等等都是有菌的。

　　這里所指的菌，包括細(xì)菌、真菌、放線菌、藻類及其他微生物。菌的特點(diǎn)是：極小，肉眼看不見。無處不在，無時(shí)不有，無孔不入。在自然條件下忍耐力強(qiáng)，生活條件要求簡(jiǎn)單，繁殖力極強(qiáng)，條件適宜時(shí)便可大量滋生。

　　無菌的范疇是：經(jīng)高溫灼燒或一定時(shí)間蒸煮過后的物體，經(jīng)其他物理或化學(xué)的滅菌方法處理后的物體，高層大氣、巖石內(nèi)部、健康的動(dòng)、植物的不與外部接觸的組織內(nèi)部，強(qiáng)酸強(qiáng)堿，化學(xué)元素滅菌劑等表面和內(nèi)部都是無菌的。

　　滅菌是指用物理或化學(xué)的方法，殺死物體表面和孔隙內(nèi)的一切微生物或生物體，即把所有生命的物質(zhì)全部殺死。與此相關(guān)的一個(gè)概念是消毒，它指殺死、消除或充分抑制部分微生物，使之不再發(fā)生危害作用，顯然經(jīng)過消毒，許多細(xì)菌芽孢、霉菌厚垣孢子等不會(huì)完全殺死，即由于在消毒后的環(huán)境里和物品上還有活著的微生物，所以通過嚴(yán)格滅菌的操作空間（接種、超凈臺(tái)等）和使用的器皿，以及操作者的衣著和手都不帶任何活著的微生物。在這樣的條件下進(jìn)行的操作，就叫做無菌操作。

　　植物組織培養(yǎng)對(duì)無菌條件的要求是非常嚴(yán)格的，甚至超過微生物的培養(yǎng)要求，這是因?yàn)榕囵B(yǎng)基含有豐富的營(yíng)養(yǎng)，稍不小心就引起雜菌污染。要達(dá)到徹底滅菌的目的，必須根據(jù)不同的對(duì)象采取不同的切實(shí)有效的方法滅菌，才能保證培養(yǎng)時(shí)不受雜菌的影響，使試管苗能正常生長(zhǎng)。

　　常用的滅菌方法可分為物理的和化學(xué)的兩類，即：物理方法如干熱（烘燒和灼燒）、濕熱（常壓或高壓蒸煮）、射線處理（紫外線、超聲波、微波）、過濾、清洗和大量無菌水沖洗等措施；化學(xué)方法是使用升汞、甲醛、過氧化氫、高錳酸鉀、來蘇水、漂白粉、次氯酸鈉、抗菌素、酒精化學(xué)藥品處理。這些方法和藥劑要根據(jù)工作中的不同材料不同目的適當(dāng)選用。

　　1．培養(yǎng)基用濕熱滅菌

　　培養(yǎng)基在制備后的24小時(shí)內(nèi)完成滅菌工序。高壓滅菌的原理是：在密閉的蒸鍋內(nèi)，其中的蒸汽不能外溢，壓力不斷上升，使水的沸點(diǎn)不斷提高，從而鍋內(nèi)溫度也隨之增加。在0.1MPa的壓力下，鍋內(nèi)溫度達(dá)121℃。在此蒸汽溫度下，可以很快殺死各種細(xì)菌及其高度耐熱的芽孢。

　　注意完全排除鍋內(nèi)空氣，使鍋內(nèi)全部是水蒸氣，滅菌才能徹底。高壓滅菌放氣有幾種不同的做法，但目的都是要排凈空氣，使鍋內(nèi)均勻升溫，保證滅菌徹底。常用方法是：關(guān)閉放氣閥，通電后，待壓力上升到0.05MPa時(shí)，打開放氣閥，放出空氣，待壓力表指針歸零后，再關(guān)閉放氣閥。關(guān)閥再通電后，壓力表上升達(dá)到0.1MPa時(shí)，開始計(jì)時(shí)，維持壓力0.1～0.15MPa，20分鐘。

　　按容器大小不同，保壓時(shí)間有所不同。如果容器體積較大，但是放置的東西數(shù)量很少，也可以減少時(shí)間。